IDENTIFICACIÓN DE CLONES MEDIANTE SONDAS

Para localizar ADN recombinante se utlizan sondas de ADN, pequeños oligonucleótidos de cadena sencilla, que se hibridan con ADN recombinante  con el que tenga complemantaridad de bases. 

Selección de clones con una sonda de ácido nucleico

Tras la clonación, se separan las bacterias que han incorporado los plásmidos recombinantes que llevan el gen de interés, de las que no llevan ese gen.

Para ello, las bacterias con plásmidos recombinantes se depositan en una nueva placa Petri, hasta hacerse visibles  las colonias. Así, obtendremos el ADN recombinante con el gen de interés.

Primero:  Se presiona ligeramente con un filtro de celulosa, haciendo que las bacterias de los distintos clones se transfieran al filtro, obteniéndose una imagen especular de las colonias. Se enumeran las colonias para conocer su posición.

Segundo:  El filtro es tratado con un detergente, para que las membranas celulares se rompan, liberándose su contenido, el ADN se desnaturaliza y se une a la nitrocelulosa.

El filtro se incuba con una sonda de ADN, haciendo que se hibride con los ADN recombinantes incorporados por el gen de interés. Las sondas no hibridadas, se eliminan mediante lavado.

Tercero: Para conocer las zonas donde se produce esta hibridación, el filtro se coloca debajo de una película fotográfica, donde quedará ennegrecida únicamente donde se haya producido la hibridación.

Cuarto: Finalmente, se comparan las marcas en la película revelada con las de la placa original, para localizar las colonias portadoras del gen de interés.